Feb 10, 2025

Public workspaceELISA Assay V.2

This protocol is a draft, published without a DOI.
  • 1University of Sao Paulo
Isis Paiva Trajano
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Protocol Citation: Isis Paiva Trajano, Wanderson da Silva dos Santos, Patrícia Passaglia, Luis Henrique Angenendt Costa 2025. ELISA Assay. protocols.io https://protocols.io/view/elisa-assay-dzcd72s6Version created by Isis Paiva Trajano
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: January 29, 2025
Last Modified: February 10, 2025
Protocol Integer ID: 119909
Keywords: ELISA, Cytokine, Interleukin
Abstract
The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is an immunological assay commonly used to measure antibodies, antigens, proteins and glycoproteins in biological samples. This ELISA assay is a sandwich ELISA, carried out in a 96 well plate to measure cytokine concentration in plasma and different tissues of rats.
Materials
  • Luvas
  • Pipeta 10 -100 µL
  • Pipeta 100 - 1000 µL
  • Pipeta 5 mL
  • Placa de ELISA 96 poços
  • Tampa adesiva
  • Isopor com gelo
  • Kit ELISA R&D Rat TNF-alpha DuoSet diluído
  • 1 L PBS 1x
  • Tween 20
  • Soro de cabra inativado
  • Reagente A
  • Reagente B
  • Solução de parada (H2SO4 + H2O)


DIA 1 - Planejamento do ensaio
DIA 1 - Planejamento do ensaio
Planejar e desenhar o layout das placas e separar os materiais.

Exemplo de layout em duplicata.

DIA 1 - Adição do Anticorpo de Captura
DIA 1 - Adição do Anticorpo de Captura
Diluir o anticorpo de captura (AC) em PBS 1x.
Volume Final (VF) da solução = 10500 µL
VF = VAC + VPBS

Valores de TNF-α, IL-1β e IL-6 dos kits diluídos em Janeiro/2025.

Pipetar 100 µL do AC diluído em cada poço.
Incubar a placa com tampa adesiva na geladeira overnight.
DIA 2 - Adição do Reagente Diluente
DIA 2 - Adição do Reagente Diluente
Preparar Wash Buffer (WB).
1000 mL PBS 1x + 500 µL Tween 20 = 1 L WB

Preparar o Reagente Diluente (RD)
6 mL RD + 54 mL H2O mQ = 600 mL RD
Descartar o conteúdo da placa.
Lavar a placa 3 vezes com 300 µL de WB em cada poço.
Obs. Após a lavagem, retirar o máximo de WB possível deixando a placa de ponta cabeça em papel e batendo a placa em papel para retirar o excesso.
Adicionar 300 µL de RD em cada poço.
Incubar a placa por 1 hora em temperatura ambiente.
Obs. Durante o intervalo:
  • Deixar as amostrar descongelando em um isopor com gelo;
  • Preparar a curva imediatamente antes do término do tempo de incubação.
DIA 2 - Preparo da curva
DIA 2 - Preparo da curva
Separar e identificar 1 tubo Eppendorf de 2 mL para cada ponto da curva.
Pipetar 300 µL de RD em todos os tubos, exceto no maior ponto da curva.

No tubo do maior ponto da curva diluir o Anticorpo Padrão (ST) em RD.
Volume Final (VF) da solução = 600 µL
VF = VST + VRD

Valores de TNF-α, IL-1β e IL-6 dos kits diluídos em Janeiro/2025.

Pipetting
Critical
Realizar a diluição seriada do ST: Pipetar 300 µL do maior ponto da curva no ponto seguinte e assim sucessivamente até que o tubo do menor ponto da curva finalize com 600 µL.
DIA 2 - Adição das amostras
DIA 2 - Adição das amostras
Descartar o conteúdo da placa.
Lavar a placa 3 vezes com 300 µL de WB em cada poço.
Obs. Após a lavagem, retirar o máximo de WB possível deixando a placa de ponta cabeça em papel e batendo a placa em papel para retirar o excesso.
Adicionar 100 µL de padrão diluído e das amostras em duplicata.
Incubar a placa com tampa adesiva em temperatura ambiente por 2 horas.
DIA 2 - Adição do Anticorpo de Detecção
DIA 2 - Adição do Anticorpo de Detecção
Diluir o Anticorpo de Detecção (AD) em RD.
Volume Final (VF) da solução = 10500 µL
VF = 200 µL soro de cabra inativado + VAD + VRD

Valores de TNF-α, IL-1β e IL-6 dos kits diluídos em Janeiro/2025.

Descartar o conteúdo da placa.
Lavar a placa 3 vezes com 300 µL de WB em cada poço.
Obs. Após a lavagem, retirar o máximo de WB possível deixando a placa de ponta cabeça em papel e batendo a placa em papel para retirar o excesso.
Adicionar 100 µL de AD em cada poço.
Incubar a placa com tampa adesiva em temperatura ambiente por 2 horas.
DIA 2 - Adição do Conjugado Estreptavidina-HRP
DIA 2 - Adição do Conjugado Estreptavidina-HRP
Diluir o conjugado Estreptavidina-HRP (EST-HRP) em RD na proporção 1:200.
VF = 10945 µL EST-HRP + 55 µL RD
Obs. A Estreptavidina é fotosensível.
Descartar o conteúdo da placa.
Lavar a placa 3 vezes com 300 µL de WB em cada poço.
Obs. Após a lavagem, retirar o máximo de WB possível deixando a placa de ponta cabeça em papel e batendo a placa em papel para retirar o excesso.
Adicionar 100 µL de EST-HRP em cada poço.
Incubar a placa com tampa adesiva em temperatura ambiente no escuro por 20 minutos.
DIA 2 - Adição do Substrato de Trabalho
DIA 2 - Adição do Substrato de Trabalho
Preparar o Substrato de Trabalho (A+B).
VF = 5,5 mL Reagente A + 5,5 mL Reagente B
Descartar o conteúdo da placa.
Lavar a placa 3 vezes com 300 µL de WB em cada poço.
Obs. Após a lavagem, retirar o máximo de WB possível deixando a placa de ponta cabeça em papel e batendo a placa em papel para retirar o excesso.
Adicionar 100 µL de Substrato de Trabalho em cada poço.
Incubar a placa com tampa adesiva em temperatura ambiente no escuro por 20 minutos.
DIA 2 - Leitura da placa
DIA 2 - Leitura da placa
Adicionar 50 µL de solução de parada em cada poço.

Tampar e homogeneizar a placa gentilmente.
Determinar a densidade óptica para cada poço usando o leitor de placa de 450 nm com correções de 540 ou 570 nm.
Protocol references